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抗酒石酸酸性磷酸酶染液说明书
发布时间:2016-06-22   点击次数:1105次

说明书

tartrate-resistant acid phosphate stain, TRAP stain

产品用途:

存在于正常人肺泡巨噬细胞等部位的TRAP和存在于细胞白血病人脾脏的TRAP均在细胞滤泡中,并不释放入血液,血液中TRAP绝大部分来源于破骨细胞。因而测量血液中TRAP可以了解破骨细胞的功能状态。本染液可用于石蜡切片、血液及骨髓涂片、细胞爬片、冰冻切片中的破骨细胞染色。

 

检验原理:

在酸性的缓冲液中,细胞内催化底物水解,其生成物进而与一种稳定的重氮盐偶联,生成不溶性的偶氮染料沉淀,当底物中存在酒石酸时,该反应只出现在特异性细胞中。

 

储存条件及有效期:

本试剂盒室温密封保存,有效期3个月。所有应用液配置后要立即使用,当天一次用完。

所需仪器:

光学显微镜、染缸、玻片、滴管、秒表、记号笔等。

试剂组成及配制:

简明试剂组成表

试剂组成

试剂编号

包装规格

一、固定液

 

40ml×1瓶

二、底物液

底物反应液(一)

甲液

  • A粉×1支
  • B液500ul×1支

乙液

  • C粉×1支
  • D液,500ul×1支

底物反应液(二)

  • E粉×1支
  • F液,500ul×1支

底物反应液(三)

G液,1ml×1支

底物反应液(四)

  • H粉×1支
  • I液,500ul×1支

三、复染液

苏木素

10ml×1瓶

甲基绿

10ml×1瓶

 

具体试剂配制及操作:

一、固定液:液体,40ml×1瓶

新鲜血涂片、细胞涂片或爬片、冰冻切片用固定液固定5~10min。石蜡包埋的切片经脱腊后不需要再固定

二、底物反应液()()()()的组成及配制:

●底物反应液()组成及配制

组成:(1)A粉×1    (2)B500ul×1

(3)C粉×1    (4)D500ul×1

配制:临用前将B液用移液器吸入A粉中充分溶解配成甲液,备用

再将D液移液器吸入C粉中充分溶解配成乙液,备用

zui后将甲液与乙液混合成底物反应(),备用

●底物反应液()组成及配制:

组成:(1)E粉×1    (2)F500ul×1

配制:临用前将底物反应液二的F液移液器吸入E粉中充分溶解配成底物反应液(),备用。

●底物反应液()G1ml×1支,备用

●底物反应液()组成及配制:

组成:(1)H粉×1    (2)I500u l×1

配制:临用前将I液移液器吸入H粉中充分溶解配成底物反应液四,备用

底物孵育液的配制:

染色缸染色孵育法:

①将底物反应液()()()()的备用液混合并充分混匀,

②先在染缸内加30 ml蒸馏水,37℃水浴10分钟,

③将底物反应液()()()()依次加入已预温的蒸馏水中,

④然后将样本玻片固定,水洗后还末完全干前,,立即将样本玻片放入已准备好的反应孵育液中,避光孵育60分钟。

三:复染液:苏木素液,10ml×1

甲基绿液,10ml×1

孵育完后,取出水洗1分钟,在玻片尚未完全干之前进行复染。

可用苏木素复染1-2分钟,或用甲基绿复染23分钟,两者取其一

样本染色前处理及染色:

血涂片及骨髓涂片

1、推片:取全血或骨髓3微升左右置载玻片上,将推玻片保持与载玻片30度角,置于血滴正前方,稍往后移与血滴接触,血滴沿推片下缘散开,再匀速沿载玻片平面平稳向前滑动,至血液铺完血膜为止。满意效果为不太薄,以免细胞太少,也不要太厚,以免太重叠。

2、凉干:使涂片在空气中自然凉干,再放入本试剂盒中的固定液内固定2~3分钟,水洗约30~60秒。

3、一定注意水洗后不要太干时放入底物液中孵育60分钟(太干后染色效果欠佳)。

石蜡切片

1、二甲苯中脱蜡5~10分钟。再换用新鲜的二甲苯,脱蜡5-10分钟。

2、无水乙醇5分钟。再90%70%乙醇各2分钟。

3、水合:蒸馏水2分钟。

冰冻切片

1、回温:将预先制好的并保存在-20℃冰箱中的冰冻切片放置到切片架上回温【注】 5-10分钟。

【注】:1)可放到37℃孵箱中进行回温;

       2)在37℃水浴箱中放置一个小盒子,再将从冰箱中取出的切片架放到小盒当中,目的是让冰冻切片回温到37℃。

2、水合:将回温好的切片,水中浸泡1~2分钟。

注意事项:

1、如样本为骨片的石蜡切片,要注意不可用硝酸脱钙,酸脱钙的方法对蛋白质(酶类)伤害较大,从面影响特异性酶染色,会使细胞中的特异性酶失活,导致酶不能跟底物结合,从而导致染色失败。建议使用专用的试剂进行脱钙,本公司有售,咨询。

2、用底物孵育液进行孵育时要注意避光。

染色结果:

阳性反应为鲜红色或深红色颗粒,定位胞浆。

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