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Bradford蛋白浓度测定试剂盒
发布时间:2016-03-24   点击次数:835次

 

组成

包装(2500微孔)

保存

5×G250染色液

100ml

2-8

PBS稀释液

30ml

2-8

蛋白标准(5mg/ml BSA)

1ml

-20

本试剂盒自订购之日起九个月内有效。本试剂盒用于酶标板或者200ul比色皿时可做2500孔。当使用2ml比色皿时可做250孔,如果是1ml比色皿时可做500孔。

考马斯亮兰G-250染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料的zui大吸收峰的位置(lmax),由465nm变为595nm,在一定的浓度范围内,测定的吸光度值A595,与蛋白质浓度成正比。Bradford法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。样品中巯基乙醇的浓度可高达1M,二硫苏糖醇的浓度可高达5mM。但受略高浓度的去垢剂影响。需确保SDS低于0.1%,Triton X-100低于0.1%,Tween 20, 60, 80低于0.06%。含去垢剂的样品推荐使用

操作说明:

一,

1.        完全溶解蛋白标准品,取10ml,加240ulPBS稀释至250ml ,使终浓度为0.2mg/ml。待测蛋白样品在什么溶液中,标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见,也可以用0.9%NaClPBS稀释标准品。

2.        5×G250染色液使用前请颠倒3-5次混匀,取1ml  5×G250染色液,加入4ml双蒸水,混匀成1×G250染色液,此1×G250染色液可在4℃保存一周。

3.        将标准品按0, 2,4,6,8,12,16,20微升分别加到96孔板中,加PBS稀释液补足到20微升。

4.        将样品作适当稀释(zui好多做几个梯度,如作2倍、4倍、8倍稀释),加20微升到96孔板的样品孔中。由于移液器在取小量时的误差,标准线前面的点可能不很准确,所以尽可能的让样品点落在标准线1/2后。

5.        各孔加入200微升稀释后的1×G250染色液,室温放置3-5分钟。

6.        用酶标仪测定A595,或560-610nm之间的其它波长的吸光度。

7.        根据标准曲线计算出样品中的蛋白浓度。

  

二,

如没有酶标仪,可用分光光度计在离心管中混匀后加入比色皿中比色。

步骤如下:

1,取八支(或者更多)干净的10ml离心管,标记上号。

2,取100ulBSA,加PBS2.4ml稀释至终浓度为0.2mg/ml

35×G250染色液使用前请颠倒3-5次混匀,取10ml  5×G250染色液,加入40ml双蒸水,混匀成1×G250染色液,此1×G250染色液可在4℃保存一周。

4,按下表加入试剂(以每孔5ml计,多余的用来润洗比色皿)

 

 

离心管号

1

2

3

4

5

6

7(样品管1

8(样品管2

9(样品管3

标准蛋白BSA

0

100ul

200ul

300ul

400ul

500ul

500ul适当稀释的样品1

500ul适当稀释的样品2

……

PBS

500ul

400ul

300ul

200ul

100ul

0

0

0

0

1×G250染色液

5ml

5ml

5ml

5ml

5ml

5ml

5ml

5ml

5ml

 

5,反应3分钟后测OD值。为了实验的准确性,可每间隔2分钟加一管染色液,每间隔2分钟测一管OD值。如下表。

离心管号

1

2

3

4

5

6

7

8

……

加染色液(分钟)

0

2

4

6

8

10

12

14

……

OD

3

5

7

9

11

13

15

17

……

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