技术文章
当前位置:IGE赛车机器人 > 技术文章 >
Qiagen试剂盒提取总RNA的过程
发布时间:2015-09-24   点击次数:1032次
   Qiagen试剂盒可以用于提取DNA和总RNA,本文就以QIAGEN RNeasy Plant Mini试剂盒为例,介绍如何提取总RNA。

  Qiagen试剂盒提取总RNA的操作过程:

  1、称取新鲜叶组织样品100 mg,液氮速冻。

  2、在预冷的研钵中研磨成细粉,转移到2 ml离心管中。注意研磨不彻底则会造成严重产量降低。

  3、待液氮挥发(但不能解冻)后,加入450 ml提取缓冲液RLT,涡旋混匀,并在56℃温育1~3 min。注意:zui好在RLT临用前加入1/100体积的14.5 M β-巯基乙醇,加后保存时间不超过1个月,RLT溶液应在1个月内使用。对于高淀粉含量的材料,可将温度提高到60℃以上防止淀粉结块。

  4、将裂解液加到离心柱(浅紫色柱)上,下接一个2 ml收集管,zui大转速离心2 min。如果将裂解液粘稠,可切去吸头顶端,用大口吸头吸取。裂解液通过柱子时被均质化,大部分组织碎片都被截留在柱子表面,只有少部分通过柱子形成沉淀,因此,应小心吸取上清液,转移到另一新离心管,不要吸细胞碎片残渣沉淀。

  5、加入0。5倍体积(225 µL)96~100%乙醇,吹打混合均匀。如果裂解液有损失,则相应减少乙醇用量。加入乙醇后,可能会出现沉淀,但对提取无影响。

  6、将混合液全部(包括沉淀675 µL)转移到吸附RNA的离心柱(粉红色柱),下接一个2 ml收集管,大于8000 g或10000 r/min离心15 sec。如果混合液体积超过700 µL,每次只加700 µL到离心柱上,按上述条件离心。弃去管内液体,重复使用收集管。

  7、加入700 µL洗脱液,大于8000 g或10000 r/min离心25 sec,弃去收集管。

  8、将离心柱转移到一新的2 ml收集管上,加入500 µL RPE液,大于8000 g或10000 r/min离心15 sec。弃去管内液体,重复使用收集管。注意:Qiagen试剂盒提供浓缩的PRE洗脱液,所心使用前必须加入4倍体积的96~100%乙醇,成为工作液。

  9、加入500 µL RPE液到离心柱上,zui大转速离心2 min,干燥离心柱,弃去收集管。残留乙醇会干扰随后的反应,这次离心要保证无乙醇残留。若有乙醇残留,以zui大转速离心1 min。

  10、把离心柱连接到一新的1。5 ml收集管上,加入20~30 µL 无RNase水,大于8000 g或10000 r/min离心1 min,洗脱RNA。若RNA产量在20 μg以上,用30~50 µL无RNase水再洗脱一次。RNA样品存于-20℃或-80℃冰箱。

  11、分光光度计测定RNA。开启紫外分光光度计,预热30 min。用DEPC处理水校正零点。用DEPC处理水稀释RNA样品30~50倍,将稀释液转移到比色杯中。读取230、260、280、310 nm的OD值。计算出样品浓度和OD比值。OD260/ OD280比值应为1。7~2。1,低于1。7,说明有蛋白质或酚污染;OD260/ OD230比值应大于2,低于此值,说明有糖、盐、胍等小分子污染。

  12、琼脂糖凝胶甲醛变性电泳。首先制备凝胶(1.2%)。称取1.2 g琼脂糖,加72 ml DEPC处理的水,加热溶化。冷却至60℃,在通风橱内加入10×凝胶缓冲液10 ml,甲醛(37%)18 ml,混匀后倒胶。然后制备样品。在离心管中,将RNA样品与5×变性上样缓冲液按4:1比例混匀。65℃温育5~10 min,迅速在冰上冷却5 min,瞬时离心数秒。上样前凝胶须预电泳5 min,随后将样品加入上样孔。以5 V/cm电压电泳1.5~2 hr。待溴酚蓝迁移至凝胶长度的2/3~4/5处结束电泳。将凝胶置于溴化乙锭溶液(0.5 µg/mL,用0.1 mol/L乙酸胺配制)中当色约30 min。紫外灯下观察结果。

  以上是Qiagen试剂盒提取总RNA的全部过程,如果您还有什么疑问,咨询北京诺博莱德科技IGE赛车机器人。

北京诺博莱德科技IGE赛车机器人版权所有   |      GoogleSitemap
北京诺博莱德科技IGE赛车机器人(www.shopitat.com)主营产品:Qiagen试剂盒,MPbio土壤提取试剂,merck-millipore试剂,罗氏蛋白酶K,cst抗体到货快
电话:
010-62817090
  • 点击这里给我发消息
  • 点击这里给我发消息
  • 点击这里给我发消息

推荐收藏该企业网站
任我赢机器人 时时彩机器人 十大博彩公司 荣鼎彩投注 广东快乐十分 微信飞单机器人 贵州快3 荣鼎彩平台 秒速牛牛官网 荣鼎国际
扫一扫访问手机站扫一扫访问手机站
访问手机站