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QIAGEN试剂盒容易被人忽视的细节
发布时间:2016-11-26   点击次数:1661次
   QIAGEN试剂盒应用过程中,有些小细节容易被人们忽视,从而影响实验结果。具体是哪些小细节呢?小编整理如下。

  1、QIAGEN试剂盒抗体浓度须优化

  我们通常会follow师兄师姐留下来的操作步骤,但是如果试剂稍有不同,则可能需要优化抗体的量。记住,非特异的抗体结合会增加背景。为了防止这一点,切勿使用过多的一抗或二抗。

  2、QIAGEN试剂盒洗涤很关键

  QIAGEN试剂盒洗涤步骤看似很无聊,其实很重要,因为如果未结合的材料(如非特异结合的抗体或检测试剂)残留在微孔板中,那么它会增加背景噪音。如有必要,可增加洗涤液中的盐浓度,这会阻止非特异结合反应。如果ELISA试剂盒实验背景过高,而您怀疑洗涤不够时,可以尝试增加洗涤次数。

  3、QIAGEN试剂盒特异性因素

  1.固相载体的选择。ELISA中常用的固相载体有微量滴定板、小珠和小试管三种,以微量滴定板zui为常见。

  2.包被物的纯度。在酶联免疫测定尤其是间接ELISA中,试剂的特异性取决于使用抗原的纯度。

  3.包被抗体的效价。具有高亲和力和高特异性的包被抗体,是决定试剂特异性的重要方面。

  4.封闭。是ELISA中重要的一步,目的是封闭固相载体表面尚未被所占据的空隙,减少后续步骤中非特异性蛋白的干扰。

  4、QIAGEN试剂盒实验封闭很重要

  封闭液的作用是让不相关的蛋白占据微孔板中潜在的结合位点。这就降低了可产生信号的抗体非特异结合的机会。您当然也希望抗体只与目的蛋白结合吧。如果您的背景过高,怀疑封闭不充分,那么您可以尝试使用更高浓度的封闭液,或适当延长封闭时间。

  如果您一直被背景问题所困扰,那么也许您该花些时间来优化封闭液。这可能需要时间,但也是值得的。目前主要有两种类型的封闭液:蛋白和非离子型去污剂。您使用的类型须取决于多个因素,包括微孔板的表面试剂、吸附的抗原、您的抗体和检测试剂。好的封闭液应降低非特异性结合,但它不应当与抗原、抗体或检测试剂发生相互作用。zui常用的非离子型去污剂是Tween-20。这种封闭液便宜、稳定,在去除洗涤过程中的一些非特异结合上很有用。但它们只在存在时起作用,因为很容易被洗掉。因此所有洗涤液中也必须添加封闭液。请勿使用高浓度(正常浓度为0.01-0.1%),它会降低特异结合,产生假阴性。另一个选择是使用蛋白和非离子型去污剂这两种封闭液,后者可协助洗涤过程中的封闭。

  蛋白封闭液则有所不同,是*的。它们与开放位点结合并封闭,同时稳定与微孔板结合的抗原分子。常用的蛋白封闭液包括牛血清白蛋白(BSA)、脱脂奶粉、正常血清和鱼明胶。血清组分的内在多样性可使它有效拦截许多不同类型的分子相互作用。不过,它的缺点在于能与Protein A和IgG抗体相互作用。解决这个问题的一种方法是使用鸡或鱼的正常血清。

  5、QIAGEN试剂盒检测试剂要适量

  另一点也很显而易见:切勿使用过多的检测试剂。如果浓度过高,或者未正确稀释,则会导致高背景。也不要显色过度,如有必要,优化一下何时应加入终止液。

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